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生物化学实验(2).ppt

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生物化学实验(2).ppt


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生物化学实验 上海大学 生命科学实验中心 2010.03~05春季学期 目录 实验一 醇脱氢酶的提取及纯化 实验二 醇脱氢酶的专一性 实验三 酵母RNA的分离 实验四 核酸的定量测定——地衣酚(苔黑酚)法 实验五 动物组织中脱氧核糖核酸的提取及纯化 实验六 脱氧核糖核酸的定量测定 实验七 发酵过程中无机磷的利用 实验八 蛋白质N-末端的制备 胰岛素的测定(DNS-Cl法) 实验一 醇脱氢酶的提取及纯化 醇脱氢酶(ADH)是广泛专一性的含锌金属酶,以NAD为辅酶,催化伯醇和醛之间的可逆反应。广泛应用于医学分析、工业生产和科学研究等方面.如:酶固定化研究、新型微生态解酒剂的开发等. 一、实验目的 以酵母为原料,利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白等方法,提取具有一定纯度的醇脱氢酶 二、实验原理 一般来说,为了使纯化过程容易进行,总是选择目的酶含量最多的生物组织为原料来进行提取纯化的。当然,也要考虑原料的来源、取材方便、经济等因素。 肝脏 来源 微生物细胞 酵母细胞 醋酸杆菌 水溶液提取 酶的提取是指在一定条件下,用适当的溶剂处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程,也称作酶的抽提。 蛋白质大部分溶于水、稀酸和稀碱溶液,提取以水溶液为主,尤以稀盐液和缓冲液对蛋白质稳定性好,溶解度大。 ①盐浓度:常用等渗溶液,0.02~0.05mol/L磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液、0.15mol/L氯化钠溶液 酵母脱氢酶以0.066mol/L磷酸氢二钠溶液提取 ②pH值的选择:在蛋白质稳定范畴内,碱性蛋白在偏酸一侧,酸性蛋白在偏碱一侧。 ③温度:防止蛋白变性、降解,通常5℃以下 对少数耐温的蛋白质和酶,可适当提高温度,使杂蛋白变性分离,有利于提纯,如酵母醇脱氢酶选择37~50℃条件下提取,效果比低温提取更好。 典型的抽提液组成: 抽提液 = 离子强度调节剂 (KCl、NaCl、蔗糖) + pH缓冲剂 (各种缓冲液) + 温度效应剂 (甘油、二甲基亚砜) + 蛋白酶抑制剂(PM3F、DIFP) + 防氧化剂 (DTT 巯基乙醇) + 重金属络合剂 (EDTA、柠檬酸) + 增溶剂 (TritonX-100) 有机溶剂沉淀法 加入有机溶剂于酶溶液中产生多种效应,这些效应结合起来,使酶沉淀。 主要效应是水的活度的降低。当有机溶剂浓度增大时,水对酶分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低,或者说溶剂的介电常数降低,因而静电吸力增大。 在憎水区域附近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代,使这些区域的溶解性增大。 但除了憎水性特别强的酶外,对多数酶来说,后者影响较小,所以总的效果是导致酶分子聚集而沉淀。 酶分离、纯化的评价 酶经分离、纯化后要确定该纯化步骤是否适宜,必须经过对有关参数的测定及计算才能确定。酶的产量是以活力单位表示,因此在整个分离过程中每一步始终贯穿比活力和总活力的检测、比较。 酶活力(Enzyme activity):酶活力是指酶催化反应的能力,它表示样品中酶的含量。1961年国际酶学会规定,l min催化lμmol分子底物转化的酶量为该酶的一个活力单位 ( 国际单位 ) ,温度为25 ℃,其它条件 (pH、离子强度) 采用最适条件。 酶的总活力为样品的全部酶活力。 总活力 = 酶活力 × 总体积 (mL) 或 = 酶活力 × 总质量 (g) 比活力 (Specific activity) :比活力是指单位蛋白质 (毫克蛋白质或毫克蛋白氮) 所含有的酶活力 (单位/毫克蛋白) 。 比活力是酶纯度指标,比活力愈高表示酶愈纯,即表示单位蛋白质中酶催化反应的能力愈大。但是,比活力仍然是个相对酶纯度指标。要了解酶的实际纯度,尚需采用电泳等测定方法。 回收率 (Yield percent) :回收率是指提纯后与提纯前酶的总活力之比。它表示提纯过程中酶的损失程度,回收率愈高,其损失愈少。 提纯倍数:提纯倍数是指提纯后前两者比活力之比。它表示提纯过程中酶纯度提高的程度,提纯倍数愈大,提纯效果愈佳。 酵母醇脱氢酶催化乙醇氧化反应 蛋白质定量法 1 Biuret 法 (双缩脲法) 2 Lowry 法 (福林-酚法) 3 UV 吸收法 4 Coomassie Blue (dye binding) 法 (考马斯亮蓝) 5 其它方法 三、实验材料、仪器与试剂 四、实验操作 (一)提取 1.提取:20g酵母干粉中加入0.066 mol/L磷酸氢二钠溶液80ml,37℃水浴保温2 h,室温搅拌3 h,离心(20min,4000rpm)收集上清液 开始:每组取25ml上清液 2.热变性沉淀杂蛋白:升温至55℃,保温20 min后迅速冷却离心(20min,4000rpm)去除热变性蛋白,上清液中多为热稳定性较高的醇脱氢酶。 3.有机溶剂沉淀杂蛋白:上清液在冰浴-2 ℃以下,按100:50加入预冷至-2 ℃的丙酮,边加边搅拌。放置5min,低温离心( 0℃,15min,4000rpm),收集上清液 4.有机溶剂沉淀酶蛋白:按100:55加入预冷至-2 ℃的丙酮,边加边搅拌。待沉淀完全后,低温离心( 0℃,15min,4000rpm),弃去上清液,沉淀溶于(2~3ml)H2O中转移至透析袋内,对冷水透析3小时。离心去沉淀,上清液为有一定纯度的酶制剂。 (二)蛋白浓度测定 上述(一)取样,用H2O稀释成1/100~1/200,用福林-酚法测定蛋白含量。 (三)酶活力测定:样品液和酶制剂均用K2HPO4溶液稀释: 粗提液: K2HPO4溶液=1:4(V/V) 热变性后样液: K2HPO4溶液=1:9(V/V) 有机溶剂去除杂蛋白样液: K2HPO4溶液=1:9(V/V) 酶制剂: K2HPO4溶液=1:9(V/V) ADH活性测定——瓦勒-霍赫法 将0.5 mL焦磷酸钠缓冲液,3M乙醇溶液0.1 mL底物溶液(空白管H2O用代替)、0.1mLNAD、2.2ml H2O加入试管,于37 ℃恒温水浴20 min,置于石英比色杯中,加入同条件浴热的酶液0.20 mL,立即记时。在连续5 min内,每隔30s读取340 nm处的吸光度,直至每分钟吸光度增大值达到稳定为止。 以A340为纵坐标,时间(s)为横坐标作图。取初速度求的酶活力。本实验以A340每分钟增加0.001所需要的酶量为一个酶活力单位。 五、 结果处理 六、 注意事项 NAD溶液最好在临用前配制。 在酶的制备及纯化中,应注意选取含酶丰富的新鲜组织材料,并尽量在低温、低离子强度下操作。 整个分离提纯过程中,不能过度搅拌,以免产生大量泡沫,使酶变性:并注意随时检测留用和弃用各部分中酶的比活力,以指导提纯工作的正确进行。 七、思考

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